注意事項(xiàng)：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時(shí)間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請(qǐng)臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測(cè)稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測(cè)稀釋液B：1×10ml。
?
實(shí)驗(yàn)過程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。
三、注意事項(xiàng)
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設(shè)立一個(gè)的PCR實(shí)驗(yàn)室。
２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲(chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。
(0.105mg/ml)Argonau 2 (C34C6) Rabbit mAb5-羥基吡-2-羧酸甲酯

(10μg/ml,u=6～5%,酮)Argonau 2 (C34C6) Rabbit mAbFmoc-L-賴氨酸鹽酸鹽

敵稗標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.100mg/ml)Bim (C34C5) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 700 Conjuga)三氟甲氧基酸

伏殺硫(標(biāo)準(zhǔn)品)CTCF Antibody2-溴-5-基吡啶

伏殺硫標(biāo)準(zhǔn)溶液(10μg/ml,u=7～3%,酮)Phospho-YB1 (Ser102) (C34A2) Rabbit mAb溴異煙酸

克螨特標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.00mg/ml)IQGAP1 (D6E3J) Rabbit mAb氨基二

三殺蟲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液(10μg/ml,u=2%)Di-Methyl-Histone H3 (Lys36) (C75H12) Rabbit mAb環(huán)磺酰

三殺蟲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液(100μg/ml,u=2%)Di-Methyl-Histone H3 (Lys36) (C75H12) Rabbit mAb5-(2-氧基)-1-甲基-基-1,6-二氫-7H-吡唑并[4,D]嘧啶-7-酮

霜霉(分析標(biāo)準(zhǔn)品,99%)Phospho-PLCbeta3 (Ser537) (D8K2R) Rabbit mAb兩性霉素 B

多聯(lián)(Aroclor 1248)標(biāo)樣(100μg/mL,基體:甲)ASF1B (C70E2) Rabbit mAb氟-2-酸

多聯(lián)(Aroclor 1221)標(biāo)樣(100.0μg/mL,基體:甲)p70 S6 Kinase Substras Antibody Sampler Kit5-溴-2-甲氧基嘧啶

多聯(lián)(Aroclor 1242)標(biāo)樣(100μg/mL,基體:甲)Phospho-IRF-3 (Ser396) (D6O1M) Rabbit mAb基胍碳酸鹽

多聯(lián) (Aroclor 1254)標(biāo)樣(100μg/mL,基體:甲)VEGF Receptor 2 Control Proins三酰酮鐵

甲基毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)溶液(10μg/ml,u=6～4%,酮)IKKε (D20G4) Rabbit mAbN-氨基哌

解毒喹(標(biāo)準(zhǔn)品)IKKε (D20G4) Rabbit mAb羧基酸

綠麥隆標(biāo)準(zhǔn)溶液(100μg/ml,u=4%)Pim-1 Antibody鹽酸萬古霉素

丹溶液(基體：異辛烷)PhosphoPlus®α-Synuclein (Ser129) Antibody Duet硫酸多粘菌素 B

敵草隆(99%)SBI-0206965代二酸二酯

牛甜菜-同型半胱氨酸S-甲基轉(zhuǎn)移酶1(BHMT)ELISA試劑盒Phospho-SEK1/MKK4 (Thr261)  酸化絲裂原活化蛋白激酶激酶4100 ul

牛胎盤生長因子(PGF)ELISA試劑盒Phospho-SEK1/MKK4 (Ser257/Thr261)  酸化絲裂原活化蛋白激酶激酶4100 ul

牛羧化不全骨鈣素(ucOC)ELISA試劑盒MEK6  絲裂原活化蛋白激酶MKK6100 ul

牛雙氫睪酮(DHT)ELISA試劑盒Phospho-MEK6 (Ser207)  酸化絲裂原活化蛋白激酶MKK6300 ul

牛瘦素(LEP)ELISA試劑盒Phospho-MEK6 (Ser202)  酸化絲裂原活化蛋白激酶MKK6100 ul

牛生長抑素(SS)ELISA試劑盒MKK7/ERK7  絲裂原活化蛋白激酶MKK7100 ul

牛生長激素釋放多肽(GHRP)ELISA試劑盒Phospho-MKK7 (Ser271/Thr275)  酸化絲裂原活化蛋白激酶MKK720 ul

牛生長激素(GH)ELISA試劑盒P53(wt-p53)  腫瘤抑制基因（野生型P53）100 ul

牛腎上腺髓質(zhì)素(ADM)ELISA試劑盒P53(wt-p53)  腫瘤抑制基因（野生型P53）300 ul
乙型流感病毒PCR檢測(cè)試劑盒廠家無胸腺癥相關(guān)蛋白DGCR6/迪格奧爾格綜合征關(guān)鍵基因6抗體3β-Hydroxyurs-11-en-28,13β-olide中文名：別名：11,12-Dehydroursolic acid lactone分子式：C30H46O3

朊蛋白DPL抗體Pomolic acid中文名：坡模酸別名：3,19-Dihydroxy-12-ursen-28-oic acid分子式：C30H48O4

肌強(qiáng)直性營養(yǎng)不良蛋白激酶抗體Betulin中文名：白樺脂醇別名：20(29)-Lupene-3,28-diol分子式：C30H50O2

神經(jīng)干細(xì)胞樹突調(diào)節(jié)蛋白DAGLα抗體Betulinic acid中文名：白樺脂酸別名：樺木酸; 白樺酸分子式：C30H48O3

雙皮層蛋白結(jié)構(gòu)域蛋白DCDC2抗體Tereticornate A中文名：別名：分子式：C40H54O6
檢測(cè)步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽性對(duì)照)，每個(gè)測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應(yīng)加入的量 N個(gè)反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對(duì)照(NTC)和陽性對(duì)照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。報(bào)告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請(qǐng)勿選擇ROX參比熒光。